研究紹介

私達の研究室では、アレルギートランスレーショナルリサーチプレシジョン・メディシンをキーワードとして研究を行っています。
 アレルギー疾患に罹患した患者さんの数は世界的に増えています。主要なアレルギー疾患として、喘息アトピー性皮膚炎アレルギー性鼻炎花粉症を含む)があげられます。我が国における喘息への罹患率は小児で6-8%、成人で3-4%であり、全部で800万人もの患者さんがいると言われています。さらに、全世界では3億人が罹患していると言われています。アトピー性皮膚炎については、我が国での医療施設受診者数は40万人と推定されていますが、20歳以下の10%もの若年者が罹患していると言われています。また、アレルギー性鼻炎の罹患率は大変高く、20-60歳全体の40%にのぼると推定されています。花粉症に限っても全人口の25%(3000万人)になります。このように数多くの患者さんが苦しんでいるアレルギー疾患に焦点を当てて研究を行うことは、その成果を社会に広く還元させられることにつながると考えています。
 アレルギー性炎症の主体は2型炎症反応です。2型炎症反応ではIL-4、IL-5、IL-13といった2型サイトカインが中心的な役割を果たしています。我々は、2型サイトカインであるIL-4IL-13のシグナル伝達機構、つまりこれらのサイトカインの細胞に対する作用についての解析を切り口として、基礎研究を展開してきました。主に、IL-4、あるいはIL-13の誘導産物を解析することにより、アレルギー疾患における新規の発症機序の解明を目指してきました。そして、それにより得られた知見を臨床応用に結びつけようとしています。つまり、アレルギー研究におけるトランスレーショナルリサーチを行ってきました。その結果、IL-4、あるいはIL-13の誘導産物のいくつかが、アレルギー疾患における診断薬、あるいは治療薬の標的となることをこれまでに見出し、その実用化を現在進めています。
 プレシジョン・メディシンとは、「患者の病態を精密に分類し, それに適合した治療法を選択する医療」を意味し、2015年1月にアメリカのオバマ大統領が提唱した後、世界的に今後の医療の目指すべき姿として捉えられています。これまで別個に提唱されてきた個別化医療、オーダーメイド医療、テーラーメイド医療、ゲノム医療、層別化医療などの概念を含んでいると考えられます。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患は、現在では一つの疾患ではなく、いくつかのサブグループから構成される症候群だと考えられています。サブグループによって治療への反応性が異なることも考えられ、そのサブグループ化の確立は、患者さんに対する治療方針の決定に重要となります。私達は、アレルギー疾患をサブグループ化するためのバイオマーカーを開発し、それを提供することで、アレルギー疾患におけるプレシジョン・メディシンの確立への貢献を目指しています。この目的のためには、臨床グループや企業との連携が必須となります。我々は、国内外の50以上の臨床グループと連携して研究を進めています。


<これまで研究室で進めてきたプロジェクトのまとめ>

1. アレルギー疾患の遺伝要因の同定

人間のゲノムは全て同じ配列ではなく、約300から1000塩基に一箇所の割合で異なる塩基が存在します。現在では、それは一塩基多型(SNP)と呼ばれ、病気への罹患性、薬剤への反応性を決めていることが知られています。一方、2型サイトカインであるIL-4IL-13は細胞表面上のレセプターに結合して、アレルギー疾患の発症に重要なシグナルを伝達します。
私たちは、アレルギー疾患の発症に重要なサイトカインやレセプターの遺伝子に、タンパク質構造や機能に影響を与える遺伝子変異、つまりSNPが存在すれば、そのSNPはアレルギー疾患における遺伝要因となるのではないかと考えました。今でこそSNPがさまざまな疾患における遺伝要因となることは常識となっていますが、私たちがこの研究を始めた1990年代半ばではまだそのような考えは定着しておらず、SNPという言葉自体存在していませんでした。この仮説は、疾患の遺伝的背景という曖昧な概念を、遺伝子レベルで説明することにつながるという点で臨床的にも基礎的にも大きな意義を持つと考え、遺伝学的手法と生化学的手法を組み合わせてこの仮説の実証に取り組みました。
 最初に、IL-4とIL-13の共通なレセプター構成成分であるIL-4レセプターa鎖を対象としました。まず、この遺伝子においてアミノ酸変異を引き起こすSNPを見つけ、健常者と喘息患者では遺伝子型の頻度が異なっていることを示しました。さらに、細胞を用いた再構成の解析により、二つの遺伝子型は機能的にも違いがあることを明らかにしました。つまり、喘息患者で出現頻度の高いSNPはシグナルを強く伝達します。このようにして、このSNPが気管支喘息の遺伝要因であることを証明しました。このSNPはアレルギー性炎症において機能的差異を見出した初めての例となり、世界的に注目されました。
 つぎにリガンドであるIL-13を対象としました。IL-13遺伝子にもアミノ酸変異を起こすSNPが存在し、健常者と喘息患者とで遺伝子型の頻度が異なっており、機能的にもシグナル伝達に差異を生じることを示しました。さらに、このIL-13遺伝子上のSNPによる機能的差異を生化学的に証明するために、リガンドとレセプターの構造的解析を行いました。IL-13とレセプターとの結合様式は構造的に明らかとなっており、結合に関与している個々のアミノ酸残基も確かめられています。私たちは、SNPによるアミノ酸変異によりIL-13タンパク質全体の構造が変化し、その結果リガンドとレセプターとの結合に影響を生じることを証明しました。

 このように、タンパク質の構造・機能を基盤として、IL-4とIL-13のシグナル伝達経路において、リガンドとレセプターに存在するアミノ酸変異を引き起こすSNPが、アレルギー性炎症の遺伝要因であることを証明しました。現在、IL-4やIL-13、あるいはその受容体を標的とした抗体が作製され、気管支喘息やアトピー性皮膚炎に対する治療薬として開発されています。私たちの研究結果がこうした治療薬の効果を説明する基盤の一つになったと考えています。

参考文献

  1. Nat Genet, vol.19, 119, 1998
  2. J Immunol, vol.162, 1227-1231, 1999
  3. Hum Mol Genet, vol.9, 549-559, 2000
  4. J Allergy Clin Immunol, vol.109, 980-987, 2002
  5. J Biol Chem, vol.280, 24915-24922, 2005
  6. J Allergy Clin Immunol, vol.120, 91-97, 2007
  7. J Biol Chem, vol.284, 24289-24296, 2009


トップへ


2. マトリックスタンパク質による炎症惹起

さまざまな炎症メディエーターが線維芽細胞や平滑筋細胞などの組織構成細胞に作用すると、マトリックスタンパク質が産生されます。このマトリックスタンパク質は普段組織の構造維持に重要な役割を果たしますが、病的状態では線維化を生じて生体機能に障害を生じます。これに加えて、最近、マトリックスタンパク質が細胞表面分子に結合して細胞機能に影響を与えることも知られ、マトリセルラータンパク質と呼ばれています。

私たちは、マトリックスタンパク質の一つであるperiostinが、マトリセルラータンパク質として機能することにより炎症惹起に関与していることを明らかにしました。
 私たちは、IL-4、IL-13の気道上皮細胞への作用を明らかにするために、DNAマイクロアレイ法を用いてその誘導遺伝子を同定しました。IL-4、IL-13の免疫細胞への作用については当時すでに明らかになっていましたが、上皮細胞などの組織構成細胞への作用についてはほとんど不明でした。マイクロアレイにより同定された膨大な数の遺伝子の中で、マトリックスタンパク質であるperiostin遺伝子に着目しました。私たちが解析を始めた当時、このタンパク質の機能はほとんど不明であり、炎症との関連性については全く知られていませんでした。PeriostinはIL-4、IL-13の誘導産物の一つであるため、アレルギー疾患の病態に関与していると考えて解析を進めた結果、まず、気管支喘息の線維化に関与していることを見出し、その後、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎などほとんどのアレルギー疾患において高発現していることを明らかにしました。
さらに、間質性肺炎や強皮症といった非アレルギー性の炎症疾患においても高発現しており、広く炎症疾患に関与した分子であることを明らかにしました。  
 Periostinの炎症惹起機序を明らかにするために、in vitroin vivoの両方の系で解析を行いました。その結果、periostinは細胞表面上のインテグリンに結合して、単独で、あるいはIL-1aやTNFaなどの炎症性サイトカインと協同して、炎症におけるマスター分子であるNF-kBを活性化することを見出しました。さらに、これと一致して、periostin欠損マウスにおいては、皮膚におけるアレルギー性炎症や肺間質の線維化が改善されることを確認しました。従来線維化は炎症機転の最終結果だと考えられてきましたが、この結果は線維化を起点として炎症がさらに増悪、遷延化することを示しており、これまでの炎症に関する概念を変える重要な基礎的知見であると考えています。

 Periostinが炎症部位において高発現していることから、このperiostinが血液などの体液に移行し、それを検出することでバイオマーカーとなるのではないかと考えました。それを検証するために、periostinを検出するELISAキットを構築し、さまざまな疾患において検討を行いました。その結果、気管支喘息、慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患のみでなく、間質性肺炎、強皮症、乾癬、増殖糖尿病網膜症、胆管細胞癌などさまざまな疾患で、ペリオスチンレベルが上昇することが判明しました。現在、periostin検出キットを体外診断薬として実用化すべく臨床性能試験の実施を進めています。また、periostinがさまざまな炎症疾患の病態形成に重要なことから治療標的になると考えており、periostinに対する中和抗体や阻害作用を持つ低分子化合物を探索して、治療薬のリード化合物として開発を進めています。

参考文献

  1. Cytokine, vol.19, 287-296, 2002
  2. J Allergy Clin Immunol, vol.118, 98-104, 2006
  3. Proc Natl Acad Sci USA, vol.104, 14765-14770, 2007
  4. Allergol Int, vol. 63, 171-180, 2014
  5. J Clin Invest, vol.122, 2590-2600, 2012
  6. J Allergy Clin Immunol, in press
  7. Eur Respir J, vol.37, 1119-1127, 2011
  8. Am J Respir Cell Mol Biol, vol.46, 677-686, 2012
  9. Br J Dermatol, vol. 168, 717-725, 2013

トップへ


3. 陰イオンによる炎症反応の惹起

炎症反応においてはさまざまなイオンの流れが変化します。私たちは、先ほどお話したperiostinと同様に、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子探索を発端として、陰イオンによる炎症反応の惹起機構の解析を進めています。まず、air-interface法という特殊な培養法を用いて、気道上皮細胞をIL-13存在下で粘液産生細胞、いわゆる杯細胞に分化させました。この細胞に発現している遺伝子をマイクロアレイで解析した結果、pendrin遺伝子が強く誘導されることを見出しました。Pendrinは細胞膜を何回も貫通している陰イオンチャネルで、ヨードイオン、塩素イオン、重炭酸イオンなどを透過させます。Pendrinは元々甲状腺腫や内耳性難聴を特徴とするペンドレッド症候群の原因遺伝子として同定されました。私たちは、まず、気管支喘息とCOPDのどちらのモデルマウスにおいても上皮細胞の管啌側に一致してpendrinが発現していることを確認しました。次に、ウイルスベクターにpendrin遺伝子を組み込んで気道上皮細胞に発現させると、気管支管腔内に粘液成分を含んだ喀痰が形成されるとともに、炎症細胞の浸潤を認めました。このことから、pendrinを透過した何らかの陰イオンが気道炎症を引き起こしていると考えました。
 私たちは、pendrinを透過する陰イオンの中で、チオシアン酸(SCN-)に着目しました。チオシアン酸はDUOXにより産生された過酸化水素(H2O2)と反応して、ペルオキシダーゼによりヒポチオシアン酸(OSCN-)となります。
ヒポチオシアン酸は抗微生物作用を発揮して生体防御システムに関与しています。私たちはヒポチオシアン酸が気道上皮細胞に作用して炎症を引き起こしているのではないかと考えました。それを証明するために、ヒポチオシアン酸産生が喘息において増強されており、この産生経路の阻害により喘息の病態が改善するかを解析しました。まず、喘息モデルマウス、あるいは喘息患者の一部では、pendrinに加えてDUOX1/2やペルオキシダーゼ(LPO, EPX, MPO)の発現が増強していることを確認し、ヒポチオシアン酸産生は亢進していると考えられました。次に、汎ペルオキシダーゼ阻害剤であるメチマゾールをマウスに投与したところ、アレルゲン投与による気道炎症の改善が認められました。さらに、私たちは、低濃度のヒポチオシアン酸は気道上皮細胞においてNF-kBを活性化するとともに、高濃度のヒポチオシアン酸はネクローシスを誘導することを見出しています(未発表)。メチマゾールは抗甲状腺薬として広く使用されている薬剤です。それが気道炎症においても有効であることを示したのは大きな驚きでした。薬剤が本来の用途とは異なる用途に用いられることをdrug repositioningと呼びます。Drug repositioningではすでに安全性が確認された薬剤を使用するため、開発費の節約や開発時間の短縮につながり、新たな薬剤開発のための選択肢として期待されています。私達の研究結果は、現在抗甲状腺薬として使用されているメチマゾールの抗喘息薬へのdrug repositioningの可能性を示唆していると言えます。

参考文献

  1. J Immunol, vol.180, 6262-6269, 2008
  2. J Allergy Clin Immunol, in press




4. アレルギー疾患におけるプレシジョン・メディシンの確立

Periostinはさまざまな炎症疾患で発現が増強しています。また、periostinは、他の細胞外マトリックスタンパク質に比べてはるかに定常状態での血中濃度が低く、病変部位から血液に移行しやすいなどの特徴を持っているため、炎症疾患に対するバイオマーカーとして適していることが判明しました。私たちは、periostinに対してさまざまなエピトープを持つモノクローナル抗体を作製して、periostin検出キットを体外診断薬として開発しています。
成人喘息患者でペリオスチン測定を行った結果、periostinが高くなる喘息の特徴として、(1)高齢発症、(2)好酸球増多、(3)FeNO高値、(4)アスピリン不耐性の合併、(5)慢性副鼻腔炎/嗅覚異常の合併、(6)呼吸機能低下があげられることがわかりました。これらの特徴を持った喘息患者は、2型炎症反応を示すとともに高度のリモデリングを示すことが知られています。これと合致して、ペリオスチン高値を示す患者は、吸入ステロイド抵抗性を示すとともに、2型炎症阻害薬の一つである抗IgE抗体に対する反応性がよいことを明らかにしました。今後、より大きな臨床研究により2型炎症阻害薬に対するコンパニオン診断薬としてのペリオスチン検出キットの検証を進めるとともに、成人喘息以外で小児喘息、好酸球性慢性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎での治療反応性におけるペリオスチン検出キットの有用性を検討する予定です。これにより、アレルギー疾患におけるプレシジョン・メディシンの確立を目指していこうと考えています。

参考文献

  1. J Allergy Clin Immunol, vol.132, 305-312, 2013
  2. Ann Allergy Asthma Immunol, vol.113, 314-320, 2014
  3. Allergol Int, vol.64, 175-180, 2015
  4. J Allergy Clin Immunol, in press
  5. J Allergy Clin Immunol, vol.190, 1449-1452, 2014
  6. Biomarker Insights, vol.8, 97-105, 2013
  7. Allergy, in press

5. 新規アトピー性様皮膚炎マウスの樹立

アトピー性皮膚炎の病因・病態は,複雑でステロイドやカルシニューリン阻害薬などの既存療法やDupilumabなどの分子標的薬でも奏功しない患者が存在します。アトピー性皮膚炎に対する治療薬の開発には,動物モデルの存在が欠かせません。私達は,多様化するアトピー性皮膚炎の病態に即した新たな動物モデルの開発に,富山大学医学部(臨床分子病態検査学講座 北島勲教授)との共同研究として着手しました。IKK2NF-kBの活性化シグナルに関連する分子です。表皮細胞特異的にIKK2を欠損するマウスは,全身の皮膚に炎症が生じ,生後2週間程度で死亡します。私達は,表皮と並ぶ皮膚の組織構成細胞である線維芽細胞にIKK2の欠損を導入することで,皮膚炎が誘導されるのではないかと考えました。しかしながら,全身の皮膚線維芽細胞にIKK2欠損を導入すると表皮の場合と同様に,全身性の炎症により早期に死亡する可能性があります。そこで,顔面の皮膚線維芽細胞と体幹部の皮膚線維芽細胞では前駆細胞の起源が異なることに着目しました。すなわち,顔面の皮膚線維芽細胞への分化能を有する頭蓋神経堤細胞でCreを発現するNestincreマウスを利用して,IKK2のコンディショナル欠損マウスを作出しました。

Nestincre;Ikk2f/fマウスは,顔面皮膚に好酸球浸潤を伴う皮膚炎を自然発症し,激しい掻破行動を示しました(掻破行動動画はこちら)。

皮疹部の遺伝子発現様式は患者のパターンと高い類似性を示すものでありました。また血清IgEやペリオスチンなどの2型炎症マーカーも亢進することが分かりました。骨髄移植実験の結果,宿主のIKK2欠損が皮膚炎発症に必須条件でありました。興味深いことに,タクロリムスなどの免疫抑制剤やJAK阻害剤による治療に抵抗性を示すモデルであることも分かりました。これらの知見は本マウスが,難治性ADや掻破の治療法開発にとって有用な動物モデルと成ることを示しています。 今後は,本マウスの皮膚炎の病態や,痒みのメカニズムを紐解くことにより,新たな治療法の開発を目指していく予定です。

参考文献

  1. J Invest Dermatol, in press



トップへ

 
Copyright (C) 2003-2017
Div. Medical Biochemistry, Saga Med. Sch.
とう